紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)來測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。同時也是一種是涵蓋臨床檢驗在內(nèi)的價廉、快速、高靈敏度的常用定量分析方法之一。利用被測物質(zhì)對光的吸收特征和吸收強度，對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種分析方法，是在比色的基礎(chǔ)上所發(fā)展起來的。紫外-可見分光光度法廣泛用于金屬、合金、鋼鐵、化工產(chǎn)品、生物材料、食品、臨床和環(huán)境樣品以及藥物中微量無機物和有機物的測定。

【資料圖】

描述物質(zhì)分子對輻射的吸收程度隨波長變化的函數(shù)關(guān)系曲線即為吸收光譜，物質(zhì)的吸收光譜具有與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征性。當(dāng)光穿過被測物質(zhì)溶液時，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化，因此能夠通過測定物質(zhì)在不同波長處的吸光度，來繪制其吸光度與波長的關(guān)系圖即得被測物質(zhì)的吸收光譜。

從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長λ_max和最小吸收波長λ_min，隨后即可通過特定波長范圍內(nèi)樣品的光譜與對照光譜或?qū)φ掌饭庾V的比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個特定波長處的吸光度比值而鑒別物質(zhì)。在用于定量時，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。

以下是在使用紫外-可見分光光度法時對溶劑、測定方以及儀器方面的要求及校正和檢定。

使用紫外-可見分光光度法時對溶劑的要求

1.當(dāng)有機溶劑含有雜原子時，通常具有很強的末端吸收。因此，要將其當(dāng)作溶劑使用時，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長，例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm；

2.當(dāng)溶劑不純時，可能會增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白(即空白光路中不置任何物質(zhì))測定其吸光度；

3.溶劑和吸收池的吸光度要求在220～240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過0.20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05。

測定時的注意事項

1.在測定時，通常需以配置供試品溶液的同批溶劑為空白對照，使用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內(nèi)測試幾個點的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確。并且吸收峰波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸光度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間為宜；

2.儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的1/10，否則測得的吸光度會偏低，因此選擇狹縫寬度的時候，應(yīng)以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增大為準(zhǔn)；

3.由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，在測定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動扣除空白讀數(shù)后再計算含量；

4.當(dāng)溶液的pH值對測定結(jié)果有影響時，應(yīng)將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調(diào)成一致。

測定法含量檢測一般有對照品比較法、吸收系數(shù)法、計算分光光度法以及比色法。

1.對照品比較法：按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：c_x=(A_x/A_r)c_r。式中c_x為供試品溶液的濃度；A_x為供試品溶液的吸光度；c_r為對照品溶液的濃度；A_r為對照品溶液的吸光度。

2.吸收系數(shù)法：按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。用本法測定時，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。

3.計算分光光度法：計算分光光度法有多種，使用時應(yīng)按各品種項下規(guī)定的方法進(jìn)行。當(dāng)吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結(jié)果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應(yīng)盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。

4.比色法：供試品本身在紫外-可見光區(qū)沒有強吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收移至可見光區(qū)，這種測定方法稱為比色法。用比色法測定時，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應(yīng)試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度，并求出其含量。也可取對照品溶液與供試品溶液同時操作，顯色后，以相應(yīng)的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按對照品比較法計算供試品溶液的濃度。

使用紫外-可見分光光度法的儀器校正及檢定

1. 波長：由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動，因此除應(yīng)定期對所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前校正測定波長。儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±lnm，500nm附近±2nm。

(1)常用汞燈中的較強譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；

(2)用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進(jìn)行校正；

(3)鈥玻璃在波長279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，需注意鈥玻璃會因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化；

(4)高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥(Ho2O3)4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。

2.吸光度的準(zhǔn)確度：可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定并計算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。

3.雜散光的檢查：可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。

關(guān)鍵詞： 分光光度法 吸收系數(shù) 不得超過